成电人物

　　近日，生命学院张勇教授团队以《A CRISPR–Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants》为题，在Nature出版集团植物科学类顶级刊物《Nature Plants》上公布了一个简短的结论：“CRISPR-Cpf1核酸酶”在植物基因组编辑和转录组调控等方面具有广泛的应用前景。

　　该论文在线发表2周以来，下载阅读量已经超过8000次，是《Nature Plants》创刊以来最受关注的这项研究论文，随后《Nature Plants》杂志发表评论文章重点介绍了生命学院张勇教授团队的植物CRISPR-Cpf1核酸酶定向编辑系统的研究工作。同样，该项研究成果在国内也引起了密切关注，其中文介绍在“生物360”（国内中文生命科学研究进展方面最全面的门户网站）上一经刊出，随即引起了广泛关注，截至2017年2月28日，其资源点击率已经超过2500次，是该站点2017年前沿研究工作介绍网文中唯一点击率过千次的条目。

渴求：编辑基因需要称手的“利器”

　　基因组编辑技术自2012年起以来，多次被Science、Nature期刊评为“年度突破”、“年度技术”，被学界公认为生物科学领域的里程碑式突破。而要编辑基因就需要找到一种能够干净利落地剪辑DNA的“基因剪刀”，这种“基因剪刀”就是在生物科学领域为人熟知的物质——酶。

　　越是要精确地编辑DNA，就越是对“基因剪刀”和“刀法”提出了更高的要求，科学家之所以对“基因剪刀”有着狂热的渴求，并如痴如醉地不断探寻新的“基因剪刀”，正是因为它的改进和升级将为整个基因编辑领域带来解放和飞跃。

　　1996年，科学家发现了第一代“基因剪刀”锌指核糖核酸酶(ZFN)，从而使基因编辑进入了发展的快车道；2010年，第二代“基因剪刀”转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）神奇地实现了基因的敲除、敲入或转录激活等功能，被视为靶向基因组编辑的一座里程碑。此后，第三代“基因剪刀”CRISPR技术也于2012年横空出世，开辟了基因编辑的新纪元。

　　时光回转到2013年1月：美国的两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9技术在细胞系中进行基因敲除的新方法。与以往的技术不同，该技术是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。

　　2015年，《Cell》报道了CRISPR-Cpf1核酸酶（一类有别于CRISPR-Cas9的2类CRISPR-Cas系统）在人源细胞的工作，这让长期关注基因编辑问题的张勇教授团队眼前一亮。

　　“既然它已经在人源细胞中试验成功，那么何不进一步推广扩展到植物领域呢？”团队主要成员、生命学院2015级博士生唐旭说，“如果CRISPR-Cpf1能够有效在植物基因组编辑中广泛使用，将给植物基因功能研究、新材料培育应用提供又一分子操作利器。”

论文第一作者、生命学院唐旭博士在沙河校区实验室

煎熬：做了八个月实验却看不见曙光

　　有别于此前的基因编辑技术，CRISPR-Cpf1是2015年底科学家从细菌中发现的一种新核酸酶，这种新核酸酶被证实可应用于小鼠、人源细胞的基因组编辑，并具有简洁、精准的优势。但CRISPR-Cpf1核酸酶是否也能在植物基因组编辑中发挥功能呢？2015年10月，在《Cell》报道了CRISPR-Cpf1在人源细胞的工作后不久，张勇教授课题组携手美国马里兰大学Yiping Qi博士课题组对此立即开展了基础研究，参与该工作的还有国内的扬州大学张韬教授课题组及美国的明尼苏达大学Daniel Voytas教授课题组。

　　张勇教授及Yiping Qi博士都曾经在明尼苏达大学Daniel Voytas教授实验室进行过长期的博士后研究工作，张韬教授是我校2012届博士毕业生，他们长期开展学术合作至今，配合密切。强大的研究团队很快组建起来，实验研究也在电子科技大学、马里兰大学、明尼苏达大学、扬州大学紧锣密鼓地开展起来。然而，时间过去了近8个月，主要研究工作却没有取得明显进展。随着CRISPR-Cpf1越来越受到关注，激烈的竞争难以避免：据联合研发团队所知，全球至少有5-10个实力强劲的植物基因组编辑研究团队也在开展Cpf1相关研究。这无异于一场科研的竞速赛，因为一旦其他团队赶在前面发表研究成果，他们的研究将变得毫无价值。

　　原来，动物和植物细胞在基因组结构、基因表达特性等方面存在的巨大差别，因此如何实现CRISPR-Cpf1系统在植物细胞中的有效基因组编辑，存在很大的挑战。尤其是当时间一点点流逝而实验却迟迟不见曙光的时候，整个研究一度陷入了低迷状态。是继续跟进，还是选择放弃，这是一个艰难的抉择。

　　但他们最终选择了坚持跟进。CRISPR-Cpf1新系统巨大的潜力，又一次驱动团队全新启航。他们不断地尝试各种方案，并一株一株地检测经过编辑的水稻植株的基因突变效率。由于实验室分散在沙河校区主楼西区的一楼和二楼，作为团队的主要成员，唐旭等团队成员几乎每天都是楼上楼下地不停跑。

　　“不尝试1600多种耐热材料，怎么可能有爱迪生发明的电灯呢？”唐旭用爱迪生发明电灯的故事比喻说，“万一我们真能找到一种材料适合做灯丝呢？”

希望：预期的效果不期而至

　　2016年6月，在深入分析前期研究策略及所获数据基础上，课题组采取了有别于传统动、植物基因表达的实验策略，通过CRISPR-Cpf1表达系统中核酶元件引入、密码子优化、顺式元件重新编制等从头设计，构建了全新的CRISPR-Cpf1植物表达系统。终于，2016年6月的一天，唐旭在一次原生质体瞬时检测实验中，不期的看见了等待已久的阳性结果。

　　随后的实验数据显示：“在测试的3个水稻内源基因的6个CRISPR-Cpf1核酸酶编辑位点中，T0再生植株的定向修饰效率均达到100%，且几乎所有定向修饰类型都为双等位突变，这是一个令人惊奇的结果。此外，我们在拟南芥中测试了两种CRISPR-Cpf1核酸酶用于抑制基因转录的研究，成功将mir159b的转录水平降低了10倍以上。”

　　“我们成功啦！”研究团队兴奋了起来！虽然在此前后已经有报道显示其他同行的同类研究已经证明CRISPR-Cpf1核酸酶在植物基因编辑中的“效果不明显”，但有这些数据在手，团队对自己的方案充满了信心。

　　然而，这个结果的获得距离发表文章还有许多数据需要完善。引领性研究工作只有第一、没有第二，因此，课题组立即制定了2016年8月底前完成所有论文发表所需数据的时间表及工作计划，协调动员所有合作单位在两国四地实验室涉及遗传元件构建、植物材料转化、高通量测序、生物信息大数据分析的实验资源投入工作。

　　“竞速赛”依然在紧张地进行——他们必须第一个发表研究成果！然而，令人可惜的是，由于实验条件的局限，他们缺乏必要的植物人工气候室培养条件，检测所需的植物材料生长状况也不稳定，最终的实验结果较预期时间延迟了2个月。没有更多的等待，课题组成员又转入紧张的手稿准备过程中。

　　在手稿完成前后1周的时间，有3篇关于植物CRISPR-Cpf1的论文在线或被接受发表在相关期刊上，这个情况可能严重影响课题组工作的发表层次。经过仔细研读发表论文的实验结果，课题组成员一致认可自己的原创性工作，设计有效、策略新颖、数据可靠、效率更高，在新颖性有可能受影响的情况下，仍然具备在顶级期刊发表的机会。

　　经过科学评估、慎重考虑，课题组选择了《Nature Plants》进行首刊投稿。于是，课题组在猴年除夕的当天收到了一份新年礼物——《Nature Plants》的手稿接受邮件！

图1 高效CRISPR-Cpf1新定向修饰系统构建、活性验证及定向修饰（A：CRISPR-Cpf1构建及原理示意图；B：基于高通量测序的CRISPR-Cpf1定向修饰活性检测；C：基于CRISPR-Cpf1的目标基因定向修饰再生植株统计；D-F：基于CRISPR-Cpf1定向修饰系统的分子及表型检测）.（图片修订自：Tang et al., 2017, Nature Plants）

前景：开启了植物育种的新天地

　　2017年2月，论文终于在《Nature Plants》上刊出。2015级博士生唐旭为论文第一作者，张勇教授为共同通讯作者，电子科技大学生命科学与技术学院/信息生物学研究中心为第一单位和通讯单位。这是我校在校博士生以第一作者身份在该期刊上发表的首篇论文。

　　“CRISPR-Cpf1系统在植物基因组编辑和转录组调控等方面具有广泛的应用前景。”这是课题组最终证明的简单结论。更通俗一点说，他们开发的这种简单、高效、特异的水稻（植物）基因组定向修饰新系统，为CRISPR–Cpf1定向修饰核酸酶系统在植物功能基因组研究及育种实践中的有效应用做出了重要贡献。

　　据介绍，目前人类所用的植物育种方式主要有“杂交选育”、“转基因”和“基因修饰”三种。其中，“杂交选育”以袁隆平院士的“超级稻”为代表，已经取得了举世瞩目的成就。然而，“杂交选育”无法保证每次杂交都可以获得理想的“后代”，因此成功的周期相对太长，获得一个新品种需要几年甚至十几年不等，由中国农业大学许启凤教授成功选育的“农大108”优质高产玉米品种甚至历经18年时间、20个世代。“转基因”方法由于会引入“外源基因”，因此存在许多不确定性并受到社会的强烈质疑。

　　而“基因修饰”虽然也要编辑基因，但它不会涉及外源基因，也就是说这种选育方法不存在物种之间的跨界风险，而且，“基因修饰”可以充分地利用植物自身的基因修复功能，相对来说是突变效果更好、选育效率更高且比较安全的一种方式。展望未来，唐旭表示，“通过基因工程等分子层面的育种方式是科技发展的大势趋，我们将在这个领域继续深入探索，真正让‘基因剪刀’为人造福！”